A. BESTIMMUNG DES GEHALTS AN FREIEM UND GESAMTGOSSYPOL
| 1. | Zweck und Anwendungsbereich Die Methode erlaubt die Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol, Gesamtgossypol und chemisch verwandten Substanzen in Samen, Mehl und Kuchen von Baumwollsaat sowie in Mischfuttermitteln, die diese Futtermittel-Ausgangsstoffe enthalten, sofern mehr als 20 mg/kg an freiem Gossypol, Gesamtgossypol und chemisch verwandten Substanzen vorhanden sind. | |||||||||
| 2. | Prinzip Gossypol wird in Gegenwart von 3-Amino-1-Propanol entweder mit einer Isopropanol-Hexan-Mischung (zur Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol) oder mit Dimethylformamid (zur Bestimmung des Gesamtgossypolgehalts) extrahiert und mittels Anilin zu Gossypoldianilin umgesetzt, dessen Extinktion bei 440 nm gemessen wird. | |||||||||
| 3. | Reagenzien | |||||||||
| 3.1. | Isopropanol-Hexan-Mischung: Isopropanol (Volumenanteil = 60 %) wird mit n-Hexan (Volumenanteil = 40 % gemischt. | |||||||||
| 3.2. | Lösungsmittel A: In einen 1-l-Messkolben werden ca. 500 ml Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1), 2 ml 3-Amino-1-Propanol, 8 ml Eisessig und 50 ml Wasser gegeben, und es wird mit Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt. Dieses Reagenz ist 1 Woche lang haltbar. | |||||||||
| 3.3. | Lösungsmittel B: In einen 100-ml-Messkolben werden 2 ml 3-Amino-1-Propanol und 10 ml Eisessig pipettiert, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit N, N-Dimethylformamid zur Marke aufgefüllt. Dieses Reagenz ist 1 Woche lang haltbar. | |||||||||
| 3.4. | Anilin: Wenn die Extinktion im Blindversuch 0,022 überschreitet, ist das Anilin über Zinkstaub unter Verwerfung der ersten und der letzten 10 % des Destillats zu destillieren. In einem braunen, geschlossenen Gefäß ist dieses Reagenz im Kühlschrank einige Monate haltbar. | |||||||||
| 3.5. | Gossypol-Standardlösung A: In einen 250-ml-Messkolben werden 27,9 mg Gossypol-Acetat eingewogen und mit Lösungsmittel A (3.2) gelöst. Dann wird mit Lösungsmittel A (3.2) zur Marke aufgefüllt. Von dieser Lösung werden 50 ml in einen 250-ml-Messkolben pipettiert, und es wird mit Lösungsmittel A (3.2) zur Marke aufgefüllt. Die Gossypol-Konzentration dieser Lösung beträgt 0,02 mg/ml. Vor Gebrauch 1 h lang bei Raumtemperatur stehen lassen. | |||||||||
| 3.6. | Gossypol-Standardlösung B: In einen 50-ml-Messkolben werden 27,9 mg Gossypol-Acetat eingewogen und mit Lösungsmittel B (3.3) gelöst. Dann wird mit Lösungsmittel B (3.3) zur Marke aufgefüllt. Die Gossypol-Konzentration dieser Lösung beträgt 0,5 mg/ml. Die Standard-Gossypol-Lösungen A und B sind vor Lichteinwirkung geschützt 24 h lang haltbar. | |||||||||
| 4. | Geräte | |||||||||
| 4.1. | Mechanisches Schüttelgerät, ca. 35 min-1. | |||||||||
| 4.2. | Spektralfotometer. | |||||||||
| 5. | Verfahren | |||||||||
| 5.1. | Einwaage Die Menge der Einwaage richtet sich nach dem vermuteten Gehalt an Gossypol in der Probe. Dabei sollte vorzugsweise mit einer geringen Einwaage und einem relativ großen aliquoten Teil des Filtrats gearbeitet werden, um genügend Gossypol für eine genaue fotometrische Messung zu erhalten. Für die Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol in Samen, Mehl und Kuchen von Baumwollsaat darf höchstens 1 g eingewogen werden; bei Mischfuttermitteln bis zu 5 gn. Ein aliquoter Teil des Filtrats von 10 ml ist in den meisten Fällen geeignet; er muss 50 bis 100 μg Gossypol enthalten. Für die Bestimmung des Gehalts an Gesamtgossypol muss 0,5 bis 5 g eingewogen werden, so dass in einem aliquoten Teil des Filtrats von 2 ml 40 bis 200 μg Gossypol enthalten sind. Die Analyse ist bei einer Raumtemperatur von etwa 20°C auszuführen. | |||||||||
| 5.2. | Bestimmung des Gehalts an freiem Gossypol Die Einwaage wird in einen 250-ml-Kolben mit Schliffhals, dessen Boden mit Glassplittern bedeckt ist, überführt. Mit Hilfe einer Pipette werden 50 ml des Lösungsmittels A (3.2) hinzugegeben. Anschließend wird der Kolben verschlossen und 1 h lang im Schüttelgerät geschüttelt. Dann wird durch einen trockenen Filter filtriert und das Filtrat in einem kleinen Kolben mit Schliffhals aufgefangen. Während der Filtration wird der Trichter mit einem Uhrglas bedeckt. Es werden gleich große aliquote Teile des Filtrats, die 50 bis 100 μg Gossypol enthalten, in 2 25-ml-Messkolben (A und B) pipettiert und gegebenenfalls mit Lösungsmittel A (3.2) auf 10 ml aufgefüllt. Dann wird der Inhalt des Kolbens (A) mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung wird als Vergleichslösung für die Messung der Probenlösung verwendet. Danach werden je 10 ml des Lösungsmittels A (3.2) in 2 weitere 25-ml-Messkolben (C und D) pipettiert. Der Inhalt des Kolbens (C) wird mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung wird als Vergleichslösung für die Messung der Blindprobenlösung verwendet. Zu den Messkolben (D) und (B) werden je 2 ml Anilin (3.4) zugegeben. Die Kolben werden dann 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) jeweils zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und 1 h lang stehen gelassen. Dann werden im Spektralfotometer bei 440 nm unter Verwendung von 1-cm-Glasküvetten die Extinktion der Blindprobe (D) im Vergleich mit der Vergleichslösung (C) und die Extinktion der Probenlösung (B) im Vergleich mit der Vergleichslösung (A) gemessen. Die Extinktion der Blindprobenlösung wird von der Extinktion der Probenlösung subtrahiert (= korrigierte Extinktion). Anhand des so ermittelten Werts wird der Gehalt an freiem Gossypol, wie unter 6 angegeben, berechnet. | |||||||||
| 5.3. | Bestimmung des Gehalts an Gesamtgossypol Eine Einwaage, die 1 bis 5 mg Gossypol enthält, wird in einen 50-ml-Messkolben gegeben; dann werden 10 ml des Lösungsmittels B (3.3) hinzugefügt. Gleichzeitig wird ein Blindversuch mit 10 ml des Lösungsmittels B (3.3) in einem anderen 50-ml-Messkolben vorbereitet. Beide Messkolben werden 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) jeweils zur Marke aufgefüllt. Es wird geschüttelt, 10 bis 15 min stehen gelassen, dann filtriert und das Filtrat in Kolben mit Schliffhals aufgefangen. Es werden jeweils 2 ml des Filtrats der Probe in 2 25-ml-Messkolben und jeweils 2 ml des Filtrats des Blindversuchs in 2 andere 25-ml-Messkolben pipettiert. Je 1 Kolben jeder Versuchsreihe wird mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) auf 25 ml aufgefüllt. Diese Lösungen werden als Vergleichslösungen verwendet. Zu den beiden anderen Messkolben werden je 2 ml Anilin (3.4) hinzugefügt. Anschließend werden die Kolben 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) auf jeweils 25 ml aufgefüllt, geschüttelt und 1 h lang stehen gelassen. Die Extinktionen werden, wie unter 5.2 für freies Gossypol angegeben, gemessen. Anhand des so ermittelten Werts wird der Gehalt an Gesamtgossypol, wie unter 6 angegeben, berechnet. | |||||||||
| 6. | Berechnung der Ergebnisse Die Berechnung der Ergebnisse kann anhand der spezifischen Extinktion (6.1) oder anhand einer Kalibrationskurve (6.2) erfolgen. | |||||||||
| 6.1. | Anhand der spezifischen Extinktion Die spezifischen Extinktionen berechnen sich unter den beschriebenen Bedingungen wie folgt: Freies Gossypol Gesamtgossypol: Der Gehalt an freiem bzw. an Gesamtgossypol der Probe wird nach folgender Formel berechnet: wobei:
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| 6.2. | Anhand einer Kalibrationskurve | |||||||||
| 6.2.1. | Freies Gossypol Es werden 2 Reihen von je 5 25-ml-Messkolben vorbereitet. In beide Reihen werden jeweils 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 bzw. 10,0 der Gossypol-Standardlösung A (3.5) pipettiert; das Volumen wird mit dem Lösungsmittel A (3.2) auf 10 ml aufgefüllt. Jeder Reihe wird ein weiterer 25-ml-Messkolben hinzugefügt, der nur 10 ml des Lösungsmittels A (3.2) enthält (Blindversuch). Die Kolben der ersten Reihe einschließlich des Kolbens für den Blindversuch werden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) auf 25 ml aufgefüllt (Vergleichsreihe). Den Kolben der zweiten Reihe, einschließlich des Blindversuchs, werden jeweils 2 ml Anilin (3.4) zugesetzt. Anschließend werden die Kolben 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser zur Entwicklung der Färbung erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und 1 h lang stehen gelassen (Standardreihe). Die Extinktion der Lösungen der Standardreihe wird gemäß 5.2 durch einen Vergleich mit den entsprechenden Lösungen der Vergleichsreihe ermittelt. Die Kalibrationskurve wird aufgestellt, indem die Extinktionswerte auf der Ordinate und die entsprechende Gossypolmenge (in μg) auf der Abszisse aufgetragen werden. | |||||||||
| 6.2.2. | Gesamtgossypol Es werden 6 50-ml-Messkolben vorbereitet. In den ersten werden 10 ml des Lösungsmittels B (3.3) und in die übrigen je 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 bzw. 10,0 ml der Gossypol-Standardlösung B (3.6) pipettiert. Der Inhalt eines jeden Kolbens wird mit dem Lösungsmittel B (3.3) auf 10 ml aufgefüllt. Anschließend werden die Kolben 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt und geschüttelt. In 2 Reihen von je 6 25-ml Messkolben werden jeweils 2,0 ml dieser Lösung pipettiert. Die Kolben der ersten Reihe werden mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) auf 25 ml aufgefüllt. (Vergleichsreihe). Den Kolben der zweiten Reihe werden jeweils 2 ml Anilin (3.4) zugesetzt. Dann werden sie 30 min lang über einem Bad mit siedendem Wasser erhitzt, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit der Isopropanol-Hexan-Mischung (3.1) zur Marke aufgefüllt, geschüttelt und 1 h lang stehen gelassen (Standardreihe). Die Extinktion der Lösungen der Standardreihe wird gemäß 5.2 durch einen Vergleich mit den entsprechenden Lösungen der Vergleichsreihe ermittelt. Die Kalibrationskurve wird aufgestellt, indem die Extinktionswerte auf der Ordinate und die entsprechende Gossypolmenge (in μg) auf der Abszisse aufgetragen werden. | |||||||||
| 6.3. | Wiederholbarkeit Die Differenz zwischen den Ergebnissen zweier paralleler Bestimmungen an ein und derselben Probe darf die folgenden Werte nicht überschreiten:
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